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· 資料簡(jiǎn)介： RNA PowerSoil® Total RNA Isolation kit 強(qiáng)力土壤® 總RNA 提取試劑盒 操作步驟更新： l （步驟3‐5）酚lv仿（pH6.5‐8.0，[用戶(hù)自備]）從原來(lái)5min 渦旋震蕩后加入，改為渦旋振蕩前加入。 l （步驟12）步驟12 的孵育改為在室溫下進(jìn)行。若原來(lái)‐20℃溫度下孵育能獲得理想得率，你可維持原溫度孵育。 簡(jiǎn)介 RNA PowerSoil® Total RNA Isolation Kit 專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)用于提取土壤微生物總RNA。試劑盒性能優(yōu)越，能始終如一地去除腐植酸、富哩酸等RT‐PCR 抑制因子獲得純凈的，可直接用于RT‐PCR 分析的高質(zhì)量純凈RNA。通過(guò)RT‐PCR擴(kuò)增RNA，證明包括堆肥、底泥、糞肥等富含有機(jī)物的各種類(lèi)型土壤，使用此試劑盒均能體現(xiàn)微生物結(jié)構(gòu)完整性。使用LifeGuard™ Soil Preservation Solution 能在采集用于RNA 提取的土樣后，運(yùn)輸保存過(guò)程中，保持細(xì)菌存活的同時(shí)使其與處休眠狀態(tài)。無(wú)論從什么地方采集土樣，抑制RNase 和DNase 的活性可保證cDNA 的全長(zhǎng)合成，以及16s rRNA profiling。LifeGuard™可保持微生物群落結(jié)構(gòu)，‐20℃ 30 天，4℃ 2 星期，室溫 1 星期。室溫下保持RNA 完整性30 天。我們不建議用RNALater 或RNAProtect 保護(hù)土壤核酸。 操作預(yù)覽 土壤微生物多樣性的動(dòng)態(tài)性根據(jù)微生物群落族群及其新陳代謝狀態(tài)變化而變化。影響因素有土壤的成分、含水量、日光照射、可利用養(yǎng)分等環(huán)境條件。RNA PowerSoil® Total RNA Isolation kit 設(shè)計(jì)可提取土壤微生物及微動(dòng)物總RNA，包括休眠、正常代謝及死亡的微生物。RNA PowerSoil® Total RNA Isolation kit 可以提供完整的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)圖及RNA 成分表。 此試劑盒僅供研究用途，非診斷用。 相關(guān)產(chǎn)品 貨號(hào) 數(shù)量 RNA PowerSoil® DNA Elution Accessory Kit 12867‐25 25 preps LifeGuard™ Soil Preservation Solution 12868‐100 100ml 12868‐1000 1000ml UltraClean Agarose, Molecular Biology Grade 15003‐50 50g 15003‐100 100g 15003‐500 500g 15003‐1000 1kg UltraClean®PCR Clean‐Up Kit 12500‐50 50 preps 12500‐100 100 preps 12500‐250 250 preps 新產(chǎn)品！試用我們的LifeGuard™ Soil Preservation Solution(MO BIO 貨號(hào)：12868‐100) 室溫下運(yùn)輸或保存土樣樣品期間保護(hù)核酸穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)30 天！ 重要提醒：此試劑盒需要用戶(hù)自備酚/lv仿/異戊醇溶液（25:24:1， pH6.5‐8.0）可從Amresc，Incorporated 或VWRInternational 公司購(gòu)買(mǎi)（見(jiàn)“酚/lv仿/異戊醇供應(yīng)商”名單），或用戶(hù)自制。 注意：苯酚及酚/lv仿/異戊醇容易被氧化呈現(xiàn)黃色或粉紅色，指示該溶液不再適合用于RNA 提取。使用帶顏色的酚/lv仿/異戊醇可能會(huì)影響*終RNA 的質(zhì)量。使用前存放于干凈的容器中，旋緊蓋子并避光4℃保存，以延長(zhǎng)保質(zhì)期。 設(shè)備要求： 15ml 管離心機(jī)（2500g） 微型離心機(jī)（13000g） 移液器（20μl~1000μl） 移液器（1ml & 10ml） 水浴加熱設(shè)備（45℃，可選） Vortex‐Genie®2 渦旋儀（MO BIO 貨號(hào)#13111‐V‐220） 渦旋儀適配器（MO BIO 貨號(hào)#13000‐V1‐15） 需要但不提供的試劑 苯酚：lv仿：異戊醇溶液 試劑盒組分 貨號(hào)：12866‐25 組分 量 Bead Tubes (with 1.5g beads) 25 Bead Solution 69ml Solution SR1 7ml Solution SR2 22ml Solution SR3 42ml Solution SR4 165ml Solution SR5 110ml Solution SR6 28ml Solution SR7 3ml RNA Capture Columns 25 15ml Collection Tubes 100 2.2ml Collection Tubes 25 △實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先逐一檢查試劑! 購(gòu)買(mǎi)現(xiàn)成酚lv仿溶液 廠(chǎng)家名稱(chēng) 試劑名稱(chēng) 貨號(hào) 體積（ml） Amresco, Incorporated Phenol: Chloroform (pH 6.7/8.0) 25:24:1 premixed with isoamyl alcohol 0883‐100 100 Amresco, Incorporated Phenol: Chloroform (pH 6.7/8.0) 25:24:1 premixed with isoamyl alcohol 0883‐400 400 VWR International Phenol: Chloroform premixed with Isoamyl Alcohol 25:24:1 100513‐510 100 VWR International Phenol: Chloroform Buffered Solution 25:24:1 IB05174 400 保存 組分室溫（15‐30℃）保存。 操作步驟： 1、加入2g 土壤樣品到一個(gè)Bead Tubes（試劑盒提供）中。注意：參考疑難點(diǎn)關(guān)于土樣加樣量問(wèn)題。 2、加入2.5ml Bead Solution、0.25ml SR1 溶液、0.8ml SR2 溶液到Bead Tubes，渦旋混勻。 這一步發(fā)生了什么：緩沖液Bead Solution 可分離微生物細(xì)胞與土壤成分。SR1 溶液含有SDS 以及其它用于細(xì)胞裂解的試劑。SDS 作為去垢劑，能破壞細(xì)胞膜上的脂肪酸、脂質(zhì)。SR2 溶液為沉淀溶液，可去除腐殖質(zhì)、細(xì)胞碎片及蛋白質(zhì)等非DNA 的有機(jī)、無(wú)機(jī)成分。有機(jī)及無(wú)機(jī)成分的污染會(huì)影響到*終RNA 的質(zhì)量并抑制下游RNA 實(shí)驗(yàn)。渦旋振蕩是樣品均質(zhì)化和細(xì)胞裂解的關(guān)鍵步驟。 注意：溫度過(guò)低時(shí)會(huì)產(chǎn)生沉淀。60℃水浴可重溶SDS，并可趁熱使用。 3、加入3.5ml 酚/lv仿/異戊醇溶液（pH6.5‐8.0，[用戶(hù)自備]），渦旋混勻直至分離層消失。 這一步發(fā)生了什么：加入酚lv仿可獲得zui佳裂解效率和得率。裂解的細(xì)胞組分留在了有機(jī)相，蛋白變性。 4、把Bead Tubes 固定在渦旋儀適配器（貨號(hào)13000‐V1‐15）上，轉(zhuǎn)速（3200rpm）渦旋連續(xù)振蕩15min。這一步發(fā)生了什么：微生物細(xì)胞在1‐3 步化學(xué)（裂解緩沖液）和機(jī)械（渦旋振蕩）力共同作用下崩解。使用MO BIO 的適配器是均質(zhì)化樣品、裂解細(xì)胞的*經(jīng)濟(jì)方法。你也可以用膠帶把Tube 管固定在渦旋儀3.5 英寸橡膠平板上。不過(guò)需要注意的是，膠帶會(huì)在渦旋振蕩過(guò)程中會(huì)松脫，造成裂解效率下降，樣品間結(jié)果不統(tǒng)一或得率不高。 5、取下Bead Tube，室溫下2500g 離心10min。 這一步發(fā)生了什么：離心使得相位分離，*終可見(jiàn)三個(gè)分離層。*下層含有蛋白、細(xì)胞碎片，中間層含有腐殖質(zhì)及其他有機(jī)無(wú)機(jī)成分，*上層含有總核酸。注意：中間層的厚薄決定于樣品類(lèi)型，富含有機(jī)質(zhì)的樣品會(huì)形成更厚的中間層。 6、小心地把Bead Tube 從離心機(jī)取下，轉(zhuǎn)移上分離層（避開(kāi)中間層及底部分離層）到一個(gè)干凈的15ml 收集管中（試劑盒提供）。中間層的厚薄視樣品類(lèi)型而定。Bead Tube 中余下的酚/lv仿/異戊醇溶液棄于專(zhuān)用廢液回收容器中。注意：富含無(wú)機(jī)物的土壤，中下分離層可能比較厚實(shí)，需要用槍頭刺入底部苯酚層。 這一步發(fā)生了什么：含有總核酸的上分離層被轉(zhuǎn)移到了一個(gè)新的Tube 管中。留下細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)和其它有機(jī)成分。注意轉(zhuǎn)移上分離層時(shí)避免吸到中間或底層溶液。 7、加入1.5ml SR3 溶液到水相分離層，渦旋混勻。4℃孵育10 分鐘。 這一步發(fā)生了什么：第二次使用沉淀劑進(jìn)一步去除蛋白質(zhì)、細(xì)胞碎片。 8、室溫2500g 離心10min。避開(kāi)沉淀小球，轉(zhuǎn)移上清到一個(gè)干凈的15ml 收集管中（試劑盒提供）。 這一步發(fā)生了什么：含有核酸的上層溶液轉(zhuǎn)移到了一個(gè)新的15ml 收集管中。剩下非核酸成分。 9、加入5ml SR4 溶液到含有上清液的收集管中，上下顛倒數(shù)次或輕輕渦旋混勻。室溫孵育30min。 注意：原來(lái)的操作說(shuō)明是‐20℃孵育30min。若你的土壤類(lèi)型在‐20℃下孵育能獲得理想的得率，請(qǐng)按照原方法進(jìn)行。 10、室溫2500g 離心30min。 11、輕輕倒掉上清，把15ml 收集管倒扣于一張吸水紙上，停留5 分鐘。 注意：根據(jù)土壤類(lèi)型，底部沉淀可能更大或更黑。 這一步發(fā)生了什么：SR4 為100%異丙醇。核酸形成沉淀后，棄去異丙醇。 12、SR5 使用前先搖勻。加入1ml SR5 溶液到15ml 收集管中。充分重懸沉淀。（注意：根據(jù)土壤類(lèi)型，沉淀物有可能難于重懸�？�45℃水浴10min，再稍微渦旋。重復(fù)直至充分重懸沉淀物。 這一步發(fā)生了什么：SR5 為的鹽溶液，可重懸步驟14 沉淀下來(lái)的核酸。同時(shí)平衡RNA capture column 濾膜，為步驟16 的沖洗和步驟20 的洗脫做準(zhǔn)備。 13、每個(gè)RNA 樣品制備一個(gè)RNA capture column（試劑盒提供）： a. 取下RNA capture column（試劑盒提供）的帽子，把RNA capture column 放入一個(gè)15ml 收集管中。Column懸掛于15ml 收集管中。 b. 加入2ml SR5 溶液到RNA capture column 中，讓其自然流下，收集在15ml 收集管中。（注意：下一步加樣前勿讓column 風(fēng)干。 14、把步驟12 獲得的RNA 提取物加到RNA capture column 中，讓其自然流下，收集在15ml 收集管中。 15、再加入1ml SR5 溶液 沖洗RNA capture column。讓其自然流下，收集在15ml 收集管中。 這一步發(fā)生了什么：加到RNA capture column 中的核酸選擇性吸附到column 濾膜上。再加1ml SR5 為了沖洗未被吸附的雜質(zhì)，準(zhǔn)備RNA 洗脫。 16、把RNA capture column 轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的15 ml 收集管中（試劑盒提供）。SR6 使用前搖勻。加1ml SR6 溶液到RNA capture column 中洗脫RNA。讓SR6 自然流下收集在15ml 收集管中。 這一步發(fā)生了什么：SR6 洗脫緩沖液為的鹽溶液，可選擇性地把RNA 從column 濾膜上洗脫下來(lái)，留下DNA、殘留的細(xì)胞碎片及抑制因子等。注意：一款新的試劑盒（貨號(hào)：12867‐25）可把剩余的DNA 洗脫下來(lái)。 17、把洗脫下來(lái)的RNA 轉(zhuǎn)移到一個(gè)2.2ml 收集管（試劑盒提供）中。加入1ml SR4 溶液。至少上下顛倒一次混勻。‐20℃孵育10min。 18、室溫13000g 離心15min，沉淀RNA。 19、棄去上清，把2.2ml 收集管倒扣在吸水紙上晾干10min。 這一步發(fā)生了什么：SR4 為100%異丙醇。洗脫的RNA 沉淀、離心、晾干，然后重懸濃縮。 20、使用100μl SR7 溶液重懸RNA 沉淀物。 這一步發(fā)生了什么：SR7 為RNase/DNase‐Free 水，用于重懸沉淀的RNA。SR7 不含EDTA。此時(shí)RNA 可直接用于下游實(shí)驗(yàn)。為了延長(zhǎng)RNA 的保存時(shí)間，可用10mM Tris pH8.0 代替SR7 重懸RNA。 （注意：對(duì)于大多數(shù)類(lèi)型土樣，*終RNA 中攜帶的DNA 并不明顯。而有機(jī)物含量特別高的樣品有可能增加 DNA 的污染。對(duì)DNA 污染比較敏感的情況下，可使用經(jīng)過(guò)檢測(cè)的引物做PCR 擴(kuò)增。瓊脂凝膠顯示有DNA 條帶的話(huà)，請(qǐng)參照疑難點(diǎn)中的DNase 處理。） LifeGurad™ Soil Preservation Solution 操作說(shuō)明 1、每克土樣加入2~2.5 倍體積的LifeGurad™ Soil Preservation Solution。如1g 土樣加入2~2.5ml LifeGuard™。若采樣時(shí)直接把土壤加入到RNA PowerSoil™的 15mlBead Tube，2g 土樣分量加5ml LifeGuard™。 注意：若處理的是沉積物等水分含量較高的樣品，每克樣品請(qǐng)加入3 倍體積的LifeGuard™。 2、渦旋或手動(dòng)搖勻，使所有土樣完全潤(rùn)濕。此時(shí)LifeGuard™溶液頁(yè)面應(yīng)該高于土樣。 3、根據(jù)實(shí)際條件‐20℃、4℃或室溫保存樣品。提取 RNA 前2500g 離心5min，移除LifeGuard™溶液。 4、若直接使用15ml Bead Tube 收集樣品，離心去除LifeGuard™溶液后直接進(jìn)入RNA PowerSoil™ Total RNA IsolationKit 說(shuō)明書(shū)步驟二繼續(xù)。使用LifeGuard™保存的各種類(lèi)型不同生物量和水分含量土壤已經(jīng)成功通過(guò)測(cè)試。沉積物水份含量較高會(huì)稀釋LifeGurad™，需要更大的體積比（3:1）。 生物量對(duì)在不同溫度條件下LifeGuard 保存微生物群落結(jié)構(gòu)的性能影響很大。對(duì)生物量未知或周?chē)h(huán)境溫度超過(guò)一般室溫（22‐25℃）的情況下，應(yīng)轉(zhuǎn)移到‐20℃或4℃，或加大LifeGuard™使用比例（＞2.5ml LifeGuard/ g 土樣）。長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸或保存土樣（超過(guò)30days），請(qǐng)于‐20℃保存土樣。 疑點(diǎn)難點(diǎn) 土樣類(lèi)型和加樣量*終RNA 的得率和純度取決于處理的土樣類(lèi)型。RNA PowerSoil™ Total RNA Isolation Kit 經(jīng)過(guò)驗(yàn)證適合處理各種類(lèi)型不同物理、化學(xué)、生物特性的土樣。高有機(jī)物含量的樣品，減少加樣量至1g 能更好地平衡RNA 得率與DNA污染。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于大多數(shù)樣品*多加樣2g。沉積物可稍微多加樣，我們?cè)?jīng)*多加樣5g。提取過(guò)程中，步驟12 SR4 使用量可增至與裂解物體積一致（注意計(jì)算SR4 消耗量）。有些土樣或沉積物鹽分含量較高，步驟13 中可見(jiàn)明顯的的白色或黃色鹽沉淀。此沉淀會(huì)減少核酸提取得率。為了克服鹽沉淀，加入SR4 后可室溫孵育30min，取代原來(lái)的‐20℃孵育。其它操作步驟不變。 酚/lv仿/異戊醇液相分離 為了保證酚/lv仿/異戊醇與水相充分分離，步驟7 要在室溫下2500g 至少離心10min。離心后，中間層的厚薄視土樣有機(jī)物含量多寡而不同。轉(zhuǎn)移上清時(shí)必須避免吸取中間層及底層。若吸取到了中間層或底層，重新離心已轉(zhuǎn)移的水相層一遍，分離水相層�；蛲煊斜椒�/中間層的水相中加入等體積（2ml）lv仿，上下顛倒數(shù)次或渦旋混勻，室溫2500g 離心10min。轉(zhuǎn)移上層水相，棄去下層苯酚/lv仿層。 SR5 重懸沉淀 高有機(jī)物含量的土樣獲得的RNA 沉淀可能難于重懸。45℃水浴加熱RNA 沉淀有助于重懸。用槍頭攪動(dòng)沉淀或渦旋也能輔助重懸。進(jìn)入步驟17 加樣到column 前必須充分重懸RNA 沉淀。未能充分重懸RNA 沉淀會(huì)減少RNA吸附，降低其自然下流的速度，導(dǎo)致RNA 損失。 Column 沖洗洗脫 RNA Capture Column 中液體只能通過(guò)重力流下，不能使用離心機(jī)或真空泵抽吸。 使用RNase‐Free DNase 消化RNA 注意：只有RNase‐Free DNase 才使用于本操作說(shuō)明。RNases 的存在會(huì)消化掉RNA。 對(duì)于絕大多數(shù)類(lèi)型土樣，RNA PowerSoil™ Total RNA Isolation Kit 不存在DNA 污染。但高有機(jī)物含量的土樣，仍有可能提取RNA 的同時(shí)帶有DNA 污染。請(qǐng)把下文操作說(shuō)明與DNase 生產(chǎn)廠(chǎng)家的說(shuō)明書(shū)結(jié)合，處理RNA。 a. 若一次處理RNA PowerSoil™ Total RNA Isolation Kit 得到的所有RNA，加入4 單位的DNase，加入適當(dāng)?shù)?/span>DNase緩沖液和水，定容至200μl。通常10X DNase 消化緩沖液為含10mM CaCl2、10mM MgCl2 的10mM Tris‐HCl緩沖液，pH7.5。 b. 37℃孵育30‐45min。 c. 計(jì)入200μl 酚/lv仿/異丙醇（pH6.5‐8.0），渦旋混勻。室溫孵育5min d. 10000g 離心5min。 e. 小心轉(zhuǎn)移上層液相到另一Tube 管中。 f. 加入1/10 體積的5M NaCl，2 倍體積的100%乙醇，上下顛倒混勻。 g. ‐20℃孵育30min，10000g 離心10min。 h. 棄去上清，晾干沉淀小球。 i. 使用與沉淀一樣體積的SR7 重懸小球。此時(shí)RNA 可不用稀釋直接用于RT‐PCR 等下游實(shí)驗(yàn)。
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